Первые попытки выделения трофобластов (экстраэмбриональные клетки плода) в крови матери были предприняты в начале 90-х годов.
Трофобласты имеют больший размер по сравнению с клетками крови + на их поверхности обнаруживаются определенные маркеры. Эти особенности использовались в попытках выделения трофобластов: применялись специальные фильтры, чтобы отфильтровать их по размеру, иммунологические ловушки по маркерам, но все эти многочисленные работы не приводили к желаемому результату вплоть до 2001 года.
ДНК плода
При гибели трофобластов, фрагменты их ДНК (а значит плода) продолжают циркулировать в крови матери. Также в крови матери циркулируют ее фрагменты ДНК, которые остаются после разрушения форменных элементов крови. Поэтому в последующем стали определять ДНК плода в крови матери, количество которого растет с увеличением срока беременности.
Секвенирование
Так как отсутствуют какие-либо маркеры, позволяющие отличить ДНК плода и ДНК матери, изначально стало применяться секвенирование (чтение) без отбора. Принцип метода: учет количества чтений, которые картируются на 21 хромосому. Учитывая то, что на 10 неделе количество ДНК плода составляет 10%, а матери 90%, и у матери нормальный кариотип, рассчитывается соответствующий коэффициент нормы и трисомии для плодовой ДНК.
Геном человека состоит из последовательности 3 млд. букв, состоящих из 4-х букв. Данная методика не может читать большие последовательности, а лишь участки по 50 букв случайным образом. Если провести аналогию с текстом, то это чтение коротких фраз в пределах одного абзаца, страницы и т.д. Полученная информация об одном из прочитанных участков, сравнивается с референсными таблицами и относится к тому или иному участку гена. Таким образом, если одинаковая информация по какой-либо хромосоме поступает повторно, мы можем сделать вывод о трисомии.
Чувствительность и специфичность метода
Метод дает возможность определять следующие патологии
* Трисомия 21, 13 и 18 хромосом.
* Моносомия Х.
* Дисомия Х.
* Трисомия Х.
* Дисомия Y.
Чувствительность метода для трисомии 21 составляет 99,7%, а специфичность 99,9%.
Данные подтверждены исследованиями в нашей лаборатории (более 1000 образцов).
Теоретически метод позволяет определять микроделеционные синдромы и моногенные заболевания, однако, это пока сопряжено с техническими сложностями, высокой стоимостью и еще не вошло в широкую практику.
В 2016 году в США и Канаде уже проведено около 1 000 000 тестов NGS, в Европе и Китае по 400 000.
Средняя стоимость теста – около 1000 долларов (в зависимости от страны).
Тесты в России
Проведение тестов в России осуществляется только у двух центров: НЦАГиП им. ак. В.И. Кулакова и компании ГЕНОАНАЛИТИКА в сотрудничестве с МГУ.
Проблема заключается в полном отсутствии нормативной базы и методических указаний Минздрава. Врачи не очень хорошо понимают, когда и как назначать проведение этого теста.
Поэтому производители создали своего рода методические указания по проведению пренатального скрининга хромосомной патологии, которые были опубликованы в журнале «Акушерство и гинекология» в августе, 2016г.
Основные тренды
* Удешевление методики за счет увеличения потока образцов.
* Введение НИПТ в качестве скрининговой диагностики.
* Инвазивная диагностика, как обязательный тест при доказательстве диагноза, выявленного по НИПТ.
Как должно быть
* Консультация пациента, решение вопроса о необходимости проведения НИПТ по показаниям.
* Забор крови в специальные пробирки и контейнеры, предоставленные лабораторией. В них кровь может храниться при комнатной температуре, при этом форменные элементы крови матери разрушаться не будут, увеличивая количество материнской ДНК.
* Логистика образцов крови в лабораторию. Пока единственная лаборатория находится в Москве.
* Загрузка образцов в установку и их анализ. Оценка и анализ результатов проводится по базе образцов, загруженных в аппарат (сравнивает по базе здоровые и нездоровые образцы с кровью пациентки). В первые несколько лет аппарат обучался и на данном этапе самообучается на каждом новом исследовании. Таким образом, чем больше исследований, тем точнее результат.
* Получение результатов тестирования врачом (около 10 дней от момента забора). При положительном тесте, рекомендации по инвазивной диагностике.
Обратная связь врач-лаборатория (создание базы данных)
Информация от врача для лаборатории
* Индекс массы тела, возраст и т.д.
* Причина, по которой пациентке назначен НИПТ.
* В случае обнаружения анеуплоидии – кариотип по результатам инвазивного исследования.
* При рождении ребенка с хромосомной аномалией – результаты молекулярного кариотипирования.
Информация от лаборатории врачу
* Концентрация свободно циркулирующей ДНК плода. Если концентрация плодовой ДНК низка, результат можно признать недействительным.
* Должны быть доступны лабораторные метрики.
* Результаты исследования. Вероятности генетических аномалий.
Что может помешать внедрению НИПТ в России
* Аппаратное решение. Согласятся ли производители предоставлять свое оборудование и реактивы для производства НИПТ в России?
* Качество программного обеспечения (необходима большая референсная популяция): базы данных «Врач-Лаборатория», проведение клинических испытаний.
* Нормативная документация. Методические указания. Регистрационные удостоверения на оборудование, реактивы, программное обеспечение.
* Срок проведения анализа – максимально быстро. Это зависит от потока образцов и возможностей аппаратно-программного комплекса.
* Логистика образцов. Доставка из отдаленных районов страны.
Основные проблемы
* Работа с частными клиниками. Часто тест назначается не по показаниям, а из экономической заинтересованности врача или клиники.
* Работа с государственными центрами – низкая информированность врачей и налаживание обратной связи с врачом.
* Кто несет ответственность в случае ложноотрицательной ошибки?! Каков правовой статус теста?
* Этическая проблема в случае определения пола плода до 12 недели (когда женщина сама может принимать решение о прерывании беременности, в том числе при нежелательном поле плода).
Недавно журнал the NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE опубликовал данные о том, что не все компании по НИПТ честны с пациентками – реальная частота ложноположительных и ложноотрицательных результатов значимо выше, заявленной в рекламе.
Причины ошибок НИПТ
* Мозаицизм – 1%. В случае аномального кариотипа трофобласта и нормального кариотипа плода будет получен ложноположительный результат (ЛП), и наоборот, при нормальном трофобласте, но аномальном плоде, будет получен ложноотрицательный (ЛО) сигнал.
* 69 хромосом (ЛО) – менее 0,1%.
* Проблемы у матери. Онкологическое заболевание (ЛП) – 0,1%.
* Низкая концентрация плодового ДНК (ЛО) – 5%
* Предыдущая беременность (ЛП) - ?
* Слишком большой ИМТ (ЛО) – 0,5%.
* Техническая (ЛП и ЛО) 0,1-1%.
Очевидно, что существует необходимость создания дешевого отечественного секвенатора и проведения клинических испытаний, а также решения этических проблем и вопроса внедрения НИПТ в ОМС.